酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，簡(jiǎn)寫(xiě)ELISA）指將抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體特異性結(jié)合進(jìn)行免疫反應(yīng)的檢測(cè)方法。其基本原理如圖1所示。目前，非洲豬瘟ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的原理主要有三種，分別是間接法、阻斷法（競(jìng)爭(zhēng)法）和雙抗原夾心法。

1. 間接法

間接法通常用于測(cè)定血清中的IgG抗體，由于只要獲得抗原，配合通用的酶標(biāo)抗豬IgG的二抗就可以快速建立ELISA方法。產(chǎn)品性能取決于抗原的純度，抗原純度不夠會(huì)導(dǎo)致非特異IgG的結(jié)合，產(chǎn)生假陽(yáng)性。其主要原理如圖2所示。

2. 阻斷法

阻斷法又叫競(jìng)爭(zhēng)法，通常用于測(cè)定血清中的IgG抗體。阻斷ELISA需要抗原和特異性的單抗或多抗。對(duì)抗原的純度要求不高，產(chǎn)品的性能取決于單抗或多抗的特異性和親和力。背景干擾低，特異性高。阻斷ELISA方法的原理如圖3所示。

3. 雙抗原夾心法

雙抗原夾心ELISA用于測(cè)定血清中IgG、IgM、IgA等總抗體。技術(shù)難度最高，需要制備高質(zhì)量的酶標(biāo)抗原。該方法不受非特異性IgG的干擾，背景干擾小，敏感性和特異性高。其原理如圖4所示。

非洲豬瘟ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的使用及其操作步驟詳見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。另外，在使用試劑盒時(shí)，應(yīng)注意以下事項(xiàng)：

1. 檢測(cè)樣本的注意事項(xiàng)

如果樣本處理或保存不當(dāng)，會(huì)出現(xiàn)溶血等情況，紅細(xì)胞破裂，血紅蛋白溢出，紅細(xì)胞中的各種蛋白和酶使血清成分變的復(fù)雜，尤其亞鐵血紅素具有HRP酶的作用，從而會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。

樣品溶血主要由以下原因造成：①采血后，不離心，連同針管一同郵寄；②采血后，低溫冷凍，然后解凍；③采血后，未及時(shí)靜置，有劇烈震蕩的情況。

避免溶血應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：①采血后，靜置2h以上 （室溫），或采血后，靜置30min后再離心（離心過(guò)早，膠凍樣血清），靜置或離心出血清后，及時(shí)分裝到EP管中妥善保存。②冷鏈運(yùn)輸樣本；③樣本的保存：室溫不超過(guò)8h，4℃不超過(guò)5天，-20℃可長(zhǎng)期保存；④檢測(cè)時(shí)，應(yīng)充分回溫并混勻，避免反復(fù)凍融；⑤嚴(yán)格按照試劑盒的稀釋比例，稀釋血清樣品。

2. 檢測(cè)環(huán)境的控制

檢測(cè)期間，注意實(shí)驗(yàn)室的溫度、光照和通風(fēng)情況，應(yīng)保證在室溫（18℃~25℃）條件下操作，不在太陽(yáng)直射或空調(diào)出風(fēng)口下試驗(yàn)。操作桌面應(yīng)保持整潔，無(wú)揮發(fā)性液體。

3. 規(guī)范樣本稀釋、加樣、轉(zhuǎn)移等操作規(guī)程

加樣用樣本的稀釋，應(yīng)先加稀釋液，再加待檢血清。

加樣期間，所加物應(yīng)加注到ELISA板孔底部，不要黏附在孔壁上。板孔內(nèi)液體輕輕搖晃，不要將液體濺出孔外，更不要產(chǎn)生氣泡，避免有弱陽(yáng)性樣品顯假陰性。

正確使用移液槍，確保移液槍的量程準(zhǔn)確，移液槍頭與移液槍是否匹配，移液的過(guò)程中盡量避免氣泡的產(chǎn)生。建議采用“吸二打一”的方式，“吸二打一”的方法：也就是吸液時(shí)移液器按到底，打液時(shí)，按到移液器第一個(gè)停止位置，慢吸液體，快速打下液體，槍頭需垂直于板孔，不可插入板孔，避免溶液掛壁和交叉污染。

4. 洗板應(yīng)注意的問(wèn)題

按說(shuō)明書(shū)操作，確保每孔所加洗滌液量的準(zhǔn)確和均一，間隔30s，人工清洗需5次，機(jī)洗3次即可，調(diào)好針頭與孔底的距離，過(guò)多會(huì)溢出板孔，污染其它樣本，過(guò)少則達(dá)不到洗滌的效果。

快速甩盡板孔內(nèi)的液體。防止板孔里的液體對(duì)流，產(chǎn)生交叉污染，最后一次洗板后，用吸水紙墊厚毛巾拍干。拍干后觀察板孔，未被清除的氣泡用未使用過(guò)的槍頭戳破或洗耳球輕輕吹破。

5. 試劑盒使用的注意事項(xiàng)

試劑盒應(yīng)在2-8℃保存，不要貼冰箱壁，避免結(jié)凍。板條若未能一次用完，剩余板條用塑料袋封口后密封2-8℃保存。

試劑盒使用前應(yīng)提前拿出至室溫，待回溫后方可使用，回溫時(shí)不要使用水浴或溫箱回溫。

使用前充分混勻，吸出的多余液體禁止倒回。

為確保檢測(cè)的結(jié)果準(zhǔn)確，不同批次的試劑盒的試劑成分都要經(jīng)過(guò)優(yōu)化處理，同時(shí)要避免不同批次間的試劑盒成分的混合使用。